UJI ENZIM

ENZIM

 

A.    TUJUAN

Mengetahui pengaruh konsentrasi enzim terhadap aktivitasnya.

B.       DASAR TEORI

Enzim adalah biokatalisator organik yang dihasilkan organisme hidup di dalam protoplasma, yang terdiri atas protein atau suatu senyawa yang berikatan dengan protein. Enzim mempunyai dua fungsi pokok sebagai berikut:

1. Mempercepat atau memperlambat reaksi kimia.

2. Mengatursejumlahreaksi yang berbeda-bedadalamwaktu yang sama.

Enzimmengkatalisreaksidengan cara meningkatkanlajureaksi. Enzimmeningkatkanlajureaksidengan cara menurunkanenergiaktivasi (energi yang diperlukanuntukreaksi).

Penurunanenergiaktivasidilakukandenganmembentukkompleksdengansubstrat. Setelahprodukdihasilkan, kemudianenzimdilepaskan. Enzimbebasuntukmembentukkompleksbarudengansubstrat yang lain.

Enzimmemilikisisiaktif, yaitubagianenzim yang berfungsisebagaikatalis.Padasisiini, terdapatgugusprostetik yang didugaberfungsisebagaizatelektrofiliksehinggadapatmengkatalisreaksi yang diinginkan.Bentuksisiaktifsangatspesifiksehinggadiperlukanenzim yang spesifik pula.Hanyamolekuldenganbentuktertentu yang dapatmenjadisubstratbagienzim.Agar dapatbereaksi, enzimdansubstratharussalingkomplementer.

Ada beberapafaktor yang memepengaruhikerjaenzim, di antaranya:

1. Suhu

Peningkatansuhumenyebabkanenergikinetikpadamolekulsubstratdanenzimmeningkat, sehinggakecepatanreaksijugameningkat.Namunsuhu yang terlalutinggidapatmenyebabkanrusaknyaenzim yang disebutdenaturasi, sedangkansuhuyang terlalurendahdapatmenghambatkerjaenzim.Pada umumnyaenzimakanbekerjabaik pada suhuoptimum, yaitu antara 300 – 40 0C.

2. pH

Perubahan pH dapatmempengaruhiperubahanasam amino kuncipadasisiaktifenzim, sehinggamenghalangisisiaktifbergabungdengansubstratnya.Setiapenzimdapatbekerjabaikpada pH optimum, masing-masingenzimmemiliki pH optimum yang berbeda.

3. KonsentrasiSubstrat

Peningkatankonsentransisubstratdapatmeningkatkankecepatanreaksibilajumlahenzimtetap.Namunpadasaatsisiaktifsemuaenzimberikatandengansubstrat, penambahansubstrattidakdapatmeningkatkankecepatanreaksienzimselanjutnya.

KonsentrasiEnzim

Kecepatanreaksidipengaruhiolehkonsentrasienzim, makinbesarkonsentrasienzimmakintinggi pula kecepatanreaksi, dengan kata lainkonsentrasienzimberbandinglurusdengankecepatanreaksi.

Enzimtripsindihasilkanolehkelenjarpancreas dan dialirkankedalamususduabelasjari( duodenum ). Enzimtripsinberfungsimengubahpeptonmenjadiasam amino yang kemudiandiangkutdarah dan dibawakeseluruhsel yang membutuhkan.

 C.  Alat dan Bahan

  • Alat
  1. Tabung reaksi
  2. Stopwatch
  3. Pipet tetes
  4. Sentrifuga klinis
  5. Pengaduk gelas
  6. Corong
  7. Spectronic 20
  • Bahan
  1. Larutan TCA 20%
  2. Larutan Kasein 1%
  3. Larutan Buffer fosfat (pH=8) 0,1 M
  4. Larutan tripsin
  5. Larutan NaOH 0,5 M
  6. Larutan HCl 5 M
  7. Reagen Follin-Ciocalteau
  8. Akuades

 D.  CARA KERJA

LarutanBlanko

LarutanKontrolt = 0 menit

1 ml larutan buffer fosfat

+ 1 ml larutantripsin

2 ml larutan buffer fosfat

+ 3 ml larutan TCA 20%

+ 4 ml larutanNaOH 0,5 M

+ 3 ml larutan TCA 20%

+ 5 ml larutankasein 5%

Diinkubasi±5 menitpada 35°C

E.   DATA PENGAMATAN

1. Variasi Enzim

No tabung Subtrat Kasein 1% dalam buffer fosfat 0,1M, pH = 8,0 Buffer Fosfat 0,1 M, pH=8,0 Tripsin dalam buffer fosfat 0,1 M, pH = 8,0 Absorbansi
It= 0 menitt= 20 menit 5 mL5 mL 1,5 mL1,5 mL 0,5 mL0,5 mL 0,082/0,1340,016/0,005
IIt= 0 menitt= 20 menit 5 mL5 mL 1,0 mL1,0 mL 1,0 mL1,0 mL 1,413/1,4521,677/1,734
IIIt= 0 menitt= 20 menit 5 mL5 mL 0,5 mL0,5 mL 1,5 mL1,5 mL 1,4200,765/0,666
IVt= 0 menitt= 20 menit 5 mL5 mL 0,0 mL0,0 mL 2,0 mL2,0 mL 1,193/1,1940,540/0,516

2. Variasi Substrat

No tabung Subtrat Kasein 1% dalam buffer fosfat 0,1M, pH = 8,0 Buffer Fosfat0,1 M, pH=8,0 Tripsin dalam buffer fosfat 0,1 M, pH = 8,0 Absorbansi
It= 0 menitt= 20 menit 2 mL2 mL 3,5 mL3,5 mL 1,5 mL1,5 mL 0,155/0,0570,056/0,033
IIt= 0 menitt= 20 menit 3 mL3 mL 2,5 mL2,5 mL 1,5 mL1,5 mL 1,447/1,4930,719/0,702
IIIt= 0 menitt= 20 menit 4 mL4 mL 1,5 mL1,5 mL 1,5 mL1,5 mL 1,3580,844/0,773
IVt= 0 menitt= 20 menit 5 mL5 mL 0,5 mL0,5 mL 1,5 mL1,5 mL 1,1524/1,15220,472/0,484

F.  PEMBAHASAN

Percobaan yang berjudul “Enzim” bertujuan untuk mengetahui pengaruh konsentrasi enzim terhadap aktivitasnya. Enzim adalah suatu protein yang mempunyai struktur tiga dimensi yang mampu mengkatalis reaksi-reaksi biologis, sehingga juga disebut biokatalisator.

Beberapa enzim memerlukan tambahan komponen kimia bagi aktivitasnya yang disebut kofaktor. Kofaktor adalah suatu molekul organik kompleks disebut sebagai koenzim atau suatu molekul anorganik seperti Fe2+, Mn2+, atau Zn2+.

Kerja suatu enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu konentrasi enzim, konsentrasi substrat, suhu, pH, dan pengaruh inhibitor. Pada suatu konsentrasi substrat tertentu, kecepatan reaksi bertambah seiring dengan bertambahnya konsentrasi enzim. Penambahan konsentrasi substrat juga akan menambah kecepatan reaksi jika konsentrasi enzim dibuat tetap. Pada suhu rendah, reaksi kimia akan berlangsung lambat dan sebaliknya.

Kerja suatu enzim juga dipengaruhi oleh pH, karena pH dapat mempengaruhi struktur ion enzim dan menyebabkan terjadinya proses denaturasi, sehingga dapat menurunkan aktivitas enzim. Sedangkan inhibitor mempengaruhi cara kerja enzim karena dapat menghambat kerja enzim dalam suatu reaksi kimia.

Enzim tripsin dapat menghidrolisis protein dalam hal ini adalah kasein menjadi asam amino dan oligopeptida, di mana banyaknya protein yang terhidrolisis sebanding dengan konsentrasi atau aktivitas enzim. Semakin besar konsentrasi enzim, semakin banyak protein yang terhidrolisis. Artinya, semakin besar interaksi antara enzim dan substrat (kasein), semakin banyak asam amino dan oligopeptida yang terbentuk.

Aktivitasenzimakankonstanjikasubstrat yang dihidrolisistelahhabismeskipunditambahkonsentrasienzim. Aktivitasenzimdapatdiamatimelaluipembentukanwarnakompleks yang terbentukdarireaksi antara hasil hidrolisis (asam amino khususnyatirosin) denganreagenfollinciocalteau, sehinggadenganspektrofotometerdapatdiukurabsorbansinya. Kompleks yang terbentukberwarnabirupekat.

Penentuanaktivitasenzimdilakukan pada kondisioptimum dimana enzimtripsinbekerja pada suhu 35oC dan pH=8 (pada ususmanusia). Berdasarkanhokum Lambert-Beerberlaku:

A=εbc

denganεadalahkoefisienekstingsi molar, b adalahtebalkuvet yang dianggap sama antara yang digunakan pada pengukuranlarutanstandarblanko dan sampel, A adalahabsorbansilarutan yang diukurdenganspektrofotometer, dan C adalahkonsentrasilarutan. Besarnya A sebandingdengan C. reaksi yang terjadiadalah:

Kaseinàasam amino + oligopeptidaà + TCA 20% àfiltrate + ReagenFollinCiocalteau

Absorbansidiukur pada λmaks               Kompleksberwarna

Dalampercobaanini, substrat yang digunakanadalahlarutankasein yang akandihidrolisisolehenzimtripsin.larutan buffer fosfatdigunakanuntukmembuat pH larutantetap pada pH optimumyaitu pH dimana enzimtripsinbekerjaoptimumyakni pada pH=8 (sesuaidengan pH ususmanusia). Larutan TCA 20% digunakanuntukmenghentikanaktivitasenzimtripsindengan cara merusak / menetralkancampuran, karena TCA bersifatasam dan jikabereaksidengan buffer fosfat yang basa, maka pH campuranakankurangdari 8 sehinggaenzimtripsinakanmati / tidakakanbekerjalagi. Selanjutfiltratdicampurdenganreagenfollinciocalteau.Reagenfollinciocalteauberfungsiuntukmembentuksenyawakompleksberwarna yang akandiukurabsorbansinya.

Penentuanaktivitasenzim pada percobaaninidiperlukan 3 macamlarutanyaitularutan control (t=0), larutansampel (t=20), dan larutanblanko. Untuklarutan control, dilakukandenganmencampurenzimtripsin, buffer fosfat, dan TCA, dihomogenkan. Setelahituditambahkasein yang telahdiinkubasiselama 5 menitdalamsuhu 35oC. Untuklarutanblanko, berisisemuapereaksikecualienzimtripsin dan kasein. Kemudianketigalarutaninidiukurabsorbansinya, dan untuksampelsendiridibuatvariasikonsentrasienzimdengankonsentrasisubstrattetap, dan variasikonsentrasisubstratdengankonsentrasienzimdibuattetap. Data absorbansi yang diperolehdigunakanuntukmengukuraktivitasdenganpersamaan:

Aktivitas= At=20 – At=0

t=20

Dari percobaandiperoleh data sebagaiberikut:

Variasi Enzim

No tabung Subtrat Kasein 1% dalam buffer fosfat 0,1M, pH = 8,0 Buffer Fosfat 0,1 M, pH=8,0 Tripsin dalam buffer fosfat 0,1 M, pH = 8,0 Absorbansi
It= 0 menitt= 20 menit 5 mL5 mL 1,5 mL1,5 mL 0,5 mL0,5 mL 0,082/0,1340,016/0,005
IIt= 0 menitt= 20 menit 5 mL5 mL 1,0 mL1,0 mL 1,0 mL1,0 mL 1,413/1,4521,677/1,734
IIIt= 0 menitt= 20 menit 5 mL5 mL 0,5 mL0,5 mL 1,5 mL1,5 mL 1,4200,765/0,666
IVt= 0 menitt= 20 menit 5 mL5 mL 0,0 mL0,0 mL 2,0 mL2,0 mL 1,193/1,1940,540/0,516

Variasi Substrat

No tabung Subtrat Kasein 1% dalam buffer fosfat 0,1M, pH = 8,0 Buffer Fosfat0,1 M, pH=8,0 Tripsin dalam buffer fosfat 0,1 M, pH = 8,0 Absorbansi
It= 0 menitt= 20 menit 2 mL2 mL 3,5 mL3,5 mL 1,5 mL1,5 mL 0,155/0,0570,056/0,033
IIt= 0 menitt= 20 menit 3 mL3 mL 2,5 mL2,5 mL 1,5 mL1,5 mL 1,447/1,4930,719/0,702
IIIt= 0 menitt= 20 menit 4 mL4 mL 1,5 mL1,5 mL 1,5 mL1,5 mL 1,3580,844/0,773
IVt= 0 menitt= 20 menit 5 mL5 mL 0,5 mL0,5 mL 1,5 mL1,5 mL 1,1524/1,15220,472/0,484

Dengan menggunakan data-data yang didapat tersebut, kemudian dihitung aktivitas enzim, konsentrasi enzim dan konsentrasi substrat. Setelah perhitungan kemudian dibuat grafik, yaitu antara Aktivitas Enzim vs Konsentrasi Enzim untuk grafik pertama, sedangkan untuk grafik kedua yaitu antara Aktivitas Enzim vs Konsentrasi Substrat (karena substranya yang dibuat bervariasi dengan konsentrasi enzim tetap). Grafik yang diperoleh adalah sebagai berikut:

Grafik hubungan Aktivitas dengan konsentrasi enzim

Konsentrasienzim (mg/ml ) Aktivitas (v)
0,0286 -0,0049
0,0571 0,0136
0,0857 -0,0352
0,1143 -0,0332

Grafik hubungan Aktivitas dengan konsentrasi substrat

KonsentrasiSubstrat (mg/ml ) Aktivitas (v)
2,857 -0,0031
4,286 -0,0379
5,714 -0,0274
7,143 -0,0337

Dari grafik dan perhitungan, dapat terlihat bahwa semakin besar konsentrasi baik enzim maupun substrat, harga aktivitas enzim makin kecil. Padahal seharusnya kenaikan konsentrasi enzim maupun konsentrasi substrat menyebabkan kenaikan aktivitas enzim, dan sebaliknya. Kesalahan yang mungkin terjadi dalam percobaan ini adalah:

  1. Karena keterbatasan waktu sehingga praktikum dilakukan tergesa-gesa sehingga kadang melakukan percobaan yang tidak sesuai dengan prosedur, misalnya tentang waktu inkubasi.
  2. Tidak dilakukannnya pengadukan saat percobaan.
  3. Bahan-bahan sudah terkontaminasi zat lain.

Kemudian dari perhitungan terlihat bahwa harga aktivitas negatif. Seharusnya aktivitas itu positif. Kesalahan yang mungkin terjadi adalah:

  1. Tidak dilakukannya pengadukan hingga homogen, hanya digojok-gojok saja.
  2. Prosedur kerja yang salah.

Saat t=0 (larutan kontrol), dilakukan dengan mencampur enzim tripsin, buffer fosfat, kemudian TCA dan dihomogenkan. Fungsi penambahan TCA untuk mematikan enzim, sehingga enzim tidak bekerja saat ditambah tripsin.Akan tetapi, sebagian besar praktikan melakukan percobaan dengan mencampur enzim tripsin, buffer fosfat, kemudian TCA tanpa dihomogenkan, sehingga nilai absorbansi pada t=0 lebih besar daripada saat t=20.

Saat t=20, pencampuran kasein, enzim tripsin, dan buffer fosfat dilakukan bertahap (satu-satu), sehingga hanya sebagian enzim saja yang bisa berfungsi untuk mengkatalisator dibentuknya produk. Enzim tripsin yang kontak telebih dahulu dengan substrat tidak akan bekerja karena pH-nya tidak sesuai. Hanyaenzimtripsindalam buffer fosfatsaja yang dapatmembantumempercepatterbentuknyaproduk.

G.    KESIMPULAN

Dari percobaan yang telahdilakukan, dapatdisimpulkan:

KonsentrasiSubstrat (mg/ml ) Aktivitas (v)
2,857 -0,0031
4,286 -0,0379
5,714 -0,0274
7,143 -0,0337
Konsentrasienzim (mg/ml ) Aktivitas (v)
0,0286 -0,0049
0,0571 0,0136
0,0857 -0,0352
0,1143 -0,0332

H.  DAFTAR PUSTAKA

Anna Poedjiadi. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI Press

Muhammad Wirahadikusumah. 1997. Biokimia, Protein, Enzim, dan Asam Nukleat. Bandung: ITB Press

Lehninger, A.L. 1988. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Erlangga

Suharsono Martoharsono. 1991. Biokimia Jilid II. Yogyakarta: UGM Press